AAV

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腺相关病毒

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疾病研究（心、肝、肺）

疾病研究（心、肝、肺）

疾病研究（心、肝、肺）

　　基于对病毒载体的深入相识和研发，越来越多的科研人yuan开shijie助病毒载体举行疾病研究。现在，病毒载体工具在差异组织器官中均有大量的应用，通过使用工具病毒载体，对疾病相关基因举行定向和组织特异性的刷新和操控，已成为科研人yuan举行疾病研究与治疗的一种手艺手段。

　　病毒载体的选择

　　

　　差异病毒载体的巨细迥异，意味着其内含基因容量存在重大差异；免疫原性的差异，意味着其体内/体外应用的chang景需要细微调整；表达时间和周期的差异，意味着MRCAT猫先生体育需要凭证研究需求举行相对应的选择。

表1 差异病毒的生物学特衴uan冉

	慢病毒	腺相关病毒	腺病毒	逆转录病毒
包膜	有	无	有	有
颗粒直径	80-100 nm	20-30 nm	90-100nm	~100nm
基因组	dsRNA	ssDNA	dsDNA	RNA
基因组巨细	9.75kb	4.7kb	36kb	~5kb
表达起shi时间	48-72h	72-96h	24-48h	48-72h
表达一连时间	> 2 months	> 6 months	< 1 month	> 2 months
体内扩散能力	一ban	强	强	一ban
免疫原性	中等	极低	强	中等
滴度规模	10⁸~10⁹TU/mL	10¹²-10¹³VG/mL	10¹¹-10¹²PFU/mL	10⁷~10⁸TU/mL
滴度检测要领	qPCR整合DNA	qPCR非整合DNA	抗原抗体免疫染色试剂盒	qPCR整合DNA
整合方式	随机高泼魅整合	定向低泼魅整合（rAAV不整合）	非整合	随机整合
应用规模	体外细胞熏染，gRNA文库筛选，体内	基于差异的血清型，体内普遍应用	嗜肝，快速表达或短期表达，血液、心脏，细胞系等	特异性只熏染破碎期的细胞

　　重组腺相关病毒载体（rAAV），一直是体内研究的明星载体，除了其免疫原性极低、清静性高、宿主细胞规模广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势外，还在于其种类多样性。

　　

　　现在研究中常用的rAAV就是使用AAV2型基因组与差异的衣壳卵白团结发生的混淆体病毒载体，一ban标志为rAAV2/N (N为差异的衣壳血清型)。重组的病毒具有AAV2型的稳固表达和基因整合能力，同时获得了差异血清型的组织熏染嗜亲性，体现出一定的器官靶向特异性。

表2 差异血清型AAV的组织嗜亲性

血清型	组织亲和性
rAAV2/1	神经系统（高滴度顺向跨突触），肌肉，骨骼。募。交
rAAV2/2	神经系统，肌肉，肝脏，血管平滑。
rAAV2/3	肌肉，肝脏，肺，眼
rAAV2/4	神经系统，肌肉，眼，脑
rAAV2/5	神经系统，肺，视网膜，肝脏，滑膜枢纽
rAAV2/6	神经系统，肺，肌肉，心脏
rAAV2/7	肌肉，肝脏
rAAV2/8	神经系统，肝脏，胰腺，视网膜，脂肪组织
rAAV2/9	神经系统，心。，视网膜，皮肤，肌肉，脂肪组织
rAAV2-retro	神经系统（逆向非跨突触）
AAV-PHP.eB	跨血脑屏障（静脉注射）
AAV-PHP.S	全外周神经（尾静脉注射）
AAV-PAN	胰腺（腹腔注射）
AAV-LUNG	肺（尾静脉注射）
AAV-DJ	视网膜，肺，肾脏，体外熏染细胞
AAV-7m8	视网膜
AAV-ShH10Y	视网膜Muller细胞
AAV-Rh10	肝脏，血液，心脏，体外熏染细胞
AAV-Anc80L65	内耳、视网膜、骨骼肌、肝脏
AAV-SCH9	SVZ区神经干细胞

　　小建议：如您不确定选择哪种血清型，可实验使用MRCAT猫先生体育生物Pandora’s Virus （AAV试用装）举行预实验，通过较量差异血清型对目的组织的熏染效果，探索最佳实验条件（注射要领、注射位点、病毒用量等），襶uan慊竦酶硐氲氖笛樾Ч＃唇拥絇andora’s Virus＞＞）

肝脏

　　肝脏是调控机体脂质代谢、血糖代谢的主要器官，其功效异常会导致脂肪肝、高胆固醇血症、高血脂症、糖尿病等疾病。

　　

　　1、注射方式

　　

　　应用病毒载体熏染肝脏一ban接纳尾静脉注射的方式。

　　

　　an照MRCAT猫先生体育生物多年的履历，使用AAV载体熏染肝脏组织一ban选取AAV2/8血清型，通过尾静脉注射手段熏染肝脏每只小鼠需要注射1x10¹⁰总滴度的病毒载体。

　　

　　MRCAT猫先生体育生物AAV熏染效果

　　

　　2、应用案例

　　

　　2.1 肝脏特异启动子TBG

　　

　　客户揭晓文章：FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝，自噬溶酶体，腺相关病毒过表达]

`

　　

　　注射方式：小鼠尾静脉注射

　　

　　载体：AAV8-TBG-Fabp1

　　

　　血清型：rAAV2/8

　　

　　注射量：200ul，2× 10¹¹ VG

　　

　　视察时间：1周

　　

　　2.2 Cre-loxp手艺在小鼠肝脏中的应用

　　

　　由于腺病毒高度嗜肝，险些90%以上会熏染肝脏，因此腺病毒可以作为肝脏特异性熏染的有用载体。将Cre腺病毒（Ad-Cre）通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内，即可实现肝脏特异衴uan泶锊⒔康幕蚯贸，从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠。

　　

　　2.3 CRISPR/Cas9手艺在小鼠肝脏中的应用

　　

　　通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件（Cas9和sgRNA）注射入小鼠体内，可以实现在肝脏中特异衴uan泶铮⑹迪指卧嗖课坏奶匾煨郧贸。此要领较量适合磨练活体实验。

胰腺

　　胰腺是一个兼有内、外渗透功效的器官，与机体消化、血糖代谢、脂质代谢等有亲近的关系，也是代谢研究的关jian目的器官之一。

　　

　　在现实研究中，使用病毒载体熏染胰腺主要有两种方式，一种是使用AAV2/8病毒载体，通过胆管将病毒注射入胰腺；另一种新要领是使用MRCAT猫先生体育生物新研发的AAV-PAN病毒载体，腹腔注射熏染胰腺：

MRCAT猫先生体育生物AAV-PAN熏染效果

心脏

　　1、注射方式

　　

　　AAV的注射方式，差异的文章中接纳了纷歧样的注射方式。总体上，一ban包罗静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射包罗尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。

　　

　　尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环，漫衍较匀称。心腔内注射需要团结自动脉嵌夹举行，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求较高。心肌内定点注射时每点注射2-5ul，效果是在注射的局部点周围表达较高，但扩散很是有限。总的来说，许多实验直接用尾静脉注射即可，可是可能需要较高剂量的病毒，若是专心肌内定点注射，即小量多点注射，可以到达很好的熏染表达效果，可是后者操作手艺难度略高，也需要破费更长的操作时间。

　　

　　团结新生鼠（出生2-10天）注射效果较量来看，新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠，消耗病毒剂量也相对较低。新生鼠的注射，一ban凭证实验室的条件来看，可以选择颈静脉注射、面部静脉注射和心腔内（左心室）注射，目的是将病毒导入血液循环中。

　　

　　2、启动子选择

　　

　　一些常用启动子如CMV、CAG、αMHC、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。许多高效的启动子由于片断较大，如αMHC，仅用于转基因小鼠等实验，不适合装载在AAV载体上。通过查阅文献，MRCAT猫先生体育发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力较量强，特殊对于大片断的驱动效果很显着，可是若是需要介导的目的基因在心脏中特异衴uan泶，则推荐使用cTnT启动子，cTnT常被用于心肌的特异衴uan泶，表达能力也很强。

　　

　　3、应用案例

　　

　　3.1 心脏特异性启动子cTNT

　　

　　客户揭晓文章：Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.

　　

　　注射方式：

　　

　　载体：AAV9

　　

　　血清型：rAAV2/9

　　

　　启动子：cTnT

　　

　　注射量：200ul，2× 10^{11^VG}

　　

　　视察时间：1周

　　

　　3.2 Cas9心脏特异性转基因小鼠

　　

　　科学家构建了带有eSpCas9（1.1）的心脏特异性转基因小鼠，通过Myh6基因的启动子（αMHC）驱动Cas9在心肌的特异衴uan泶铩αMHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。这个工具小鼠能够解决实验历程中Cas9在心脏递送和表达的难题。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏恒久高水平的表达，而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。

　　

　　Cas9转基因小鼠，只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现，这种要领可以获得较量高的编辑效率。研究人yuan将靶向Myh6基因外显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入小鼠，实现心脏特异性敲除。Myh6表达水平降低50%以上，同时乐成获得发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。

肺部

　　现在对于肺部的病毒熏染，普遍接纳AAV病毒载体，使用病毒载体熏染胰腺主要有两种方式，一种是使用AAV2/9病毒载体，通过鼻内或气管内递送（经呼吸道）将病毒通过肺呼吸道递送，参考剂量是1×10¹¹VG病毒，体积50ul；另一种新要领是使用MRCAT猫先生体育生物新研发的AAV-LUNG病毒载体，尾静脉注射特异性熏染肺部：

　　

　　MRCAT猫先生体育AAV-LUNG熏染肺部效果

肌肉

　　现在，对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会选用AAV病毒载体，由于AAV不仅能够高效特异地靶向肌肉组织，且能在肌肉组织中表达持久。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反映，而且很容易被扫除，表达时间较量短暂，较少被应用于肌肉组织的靶向表达。只管慢病毒熏染表达规模普遍，对作育的肌肉细胞均能高效表达，可是对肌肉组织的熏染表达很是有限。现在靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1，AAV6和AAV9。其中，AAV9的表达效率最高，而且更容易在肌肉中高表达。

　　

　　1、注射方式

　　

　　应用病毒载体熏染肌肉组织举行研究，一ban分为系统注射和肌肉内注射，系统注射表达较匀称，可是大部门病毒会被其他脏器组织吸收，导致靶向肌肉的病毒较少。肌肉内注射是一种定点注射，可以在注射点周围高效表达，但弱点是病毒扩散十分有限，因此wangwang需要多点注射，一ban每个点在5-10ul。

　　

　　2、应用案例

　　

　　注射方式：静脉注射

　　

　　载体：AAV-CMV-miniDystrophin

　　

　　血清型：rAAV2/9

　　

　　视察时间：16周

脂肪组织

　　脂肪组织由大量脂肪细胞组成，分为白色脂肪、棕色脂肪和米色脂肪组织，脂肪组织是机体冗余能量储存的主要器官，同时也是主要的渗透器官，在机体的血糖代谢、脂质代谢、慢性炎症、伤疤修复等中有主要的心理功效。

　　

　　研究中，若是MRCAT猫先生体育使用病毒载体熏染脂肪组织，一ban接纳定点注射的方式。使用AAV病毒载体熏染脂肪组织一ban选取rAAV2/8血清型，在脂肪组织的多点注射中，每个点注射量约莫1x10¹⁰总滴度的病毒载体。

　　AAV熏染脂肪

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